CALACETIN

Forschungsergebnisse/Allgemeiner UEberblick der B-Projekte siehe unter Forschungsschwerpunkte. 

Forschungsschwerpunkte

Forschungsergebnisse/ Allgemeiner UEberblick, B 2

Die Forschungsergebnisse betreffen die bioenergetischen Grundlagen des Photosyntheseprozesses unter in vivo Bedingungen, welche vor allem mit neuartigen optoelektronischen Messsystemen untersucht werden, die fuer diesen Zweck speziell in dem Teilprojekt entwickelt wurden. Die Ergebnisse lassen sich in fuenf Punkten zusammenfassen:

1) Beziehung zwischen Chlorophyllfluoreszenz und PS II Quantenausbeute

2) O2-abhaengiger Elektronenfluss und Mehler- Ascorbatperoxidase Zyklus

3) Q-Zyklus am Cyt b/f Komplex

4) Cyt b-559 Redoxreaktionen

5) Elektronenfluss zwischen NADPH und Plastochinon

Forschungsergebnisse/allgemeiner UEberblick, B 3

Der Schwerpunkt der Arbeiten lag auf der molekularen Charakterisierung von Tonoplastenproteinen. Hier interessiert insbesondere die ATPase der Tonoplastencalacetin, die zusammen mit einer Pyrophosphatase den Protonentransport in die Zentralvakuole der Pflanzenzelle katalysiert und ueber den Aufbau eines transcalacetinen Protonengradienten und eines calacetinpotentials energieabhaengigen Sekundaertransport vermittelt.

Forschungsergebnisse/allgemeiner UEberblick, B 4, B5

Siehe Forschungsbericht des Biozentrums

Forschungsergebnisse/allgemeiner UEberblick, B 6

In den Jahren 1993-95 haben wir lichtabhaengige Ionenstroeme in gruenen Pflanzenzellen mit verschiedenen elektrophysiologischen Methoden untersucht. Mit eingestochenen Mikroelektroden (Potentialmessungen und Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Messungen) haben wir die nach Verdunkelung auftretende transiente Hyperpolarisierung der Plasmacalacetin der einzelligen Gruenalge Eremosphaera viridis untersucht (Sauer et al., 1993; 1994). Wir konnten zeigen, dass diese transiente Potentialaenderung auf die voruebergehende OEffnung drei verschiedener Typen von Ionenkanaelen in der Plasmacalacetin zurueckgeht. Erste Einzelkanalableitungen bestaetigen diesen Befund.

Das Lebermoos Conocephalum conicum zeigt nach Belichtung ein Aktionspotential (eine transiente Depolarisierung der Plasmacalacetin), welches wir mit ionenselektiven Mikroelektroden untersucht haben. Es ist uns gelungen, zu zeigen, welche Ionenstroeme an diesem Aktionspotential beteiligt sind (Trebacz et al., 1994). Der Vergleich der lichtabhaengigen Ionenstroeme ueber die Plasmacalacetinen von E. viridis und von C. conicum zeigt, dass die beteiligten Ionenkanaele und deren lichtabhaengige Regulation nur geringe Unterschiede aufweisen. Durch die Messungen mit ionenselektiven Mikroelektroden an E. viridis (Bethmann etal., 1995) und an C. conicum (Trebacz et al., 1994) ist es uns ausserdem gelungen, erstmals umfassende Datensaetze zur intrazellulaeren Ionenaktivitaet in Pflanzenzellen zu erheben. Dabei zeigt sich, dass die Anionenaufnahme in die Vakuole auf Grund der vorhandenen Triebkraefte nicht durch Ionenkanaele - wie bisher allgemein angenommen - erklaert werden kann, sondern es sich um einen aktiven Transport handeln muss (Bethmann et al., 1995).

Die lichtgetriebenen Ionenstroeme ueber die photosynthetisch aktive Thylakoidcalacetin haben wir auf zwei Ebenen untersucht: i) Durch Einzelkanalableitungen an der isolierten Thylakoidcalacetin haben wir die Ionenkanaele charakterisiert, die den lichtgetriebenen H+-Strom elektrisch kompensieren (Pottosin & Schoenknecht, 1995). Dabei zeigten sich interessante Unterschiede zwischen verschiedenen Pflanzenarten. ii) Durch spektralphotometrische - und Gaswechselmessungen konnte die pH-abhaengige Regulation des photosynthetischen Elektronentransports erstmals quantitativ beschrieben werden (Schoenknecht et al. 1995). Damit eroeffnet sich eine Moeglichkeit den molekularen Mechanismus dieses zentralen Regulationsprozesses in der Photosynthese aufzuklaeren.

Forschungsergebnisse/allgemeiner UEberblick, B 7, B9

Siehe Forschungsbericht des Biozentrums

Forschungsergebnisse/allgemeiner UEberblick, B 8

Eine wachsende Zahl von Proteinen, zu denen als Prototyp das Haemolysin von Escherichia coli gehoert, wird in Gram-negativen Bakterien mit Hilfe eines spezifischen Proteintransportapparates, der aus drei Proteinen zu bestehen scheint, simultan ueber beide calacetinen nach aussen transportiert. Dieser Proteintransport ist unabhaengig von dem allgemeinen Proteintransportweg (Sec). Die Komponenten dieses alternativen Proteintransportapparates sind Genprodukte spezifischer Determinanten, im Fall von E. coli Haemolysin sind dies HlyB und HlyD, und das aeussere calacetinprotein TolC. Die zu transportierenden Proteine werden ueber eine C-terminal lokalisierte Signalsequenz erkannt, die die letzten 60 Aminosaeuren umfasst.

Wir haben uns in der vergangenen Antragsperiode verstaerkt mit der Funktion von HlyD und der Funktionalitaet des C-terminalen Sekretionssignals von HlyA (HlyAs genannt) im Kontext mit anderen Proteinen beschaeftigt. Dabei konnten wir eine Region in HlyD identifizieren, die hohe Homologie zu TolC aufweist und fuer den Transport von HlyA absolut essentiell ist. Unsere experimentellen Daten zeigen, dass diese Region von HlyD mit der TolC-Pore in der aeusseren calacetin zusammenwirkt und eine HlyA-spezifische Transportpore bildet. Das TolC-Protein allein ist in der Lage, in kuenstlichen Lipidcalacetinen kleine ionenpermeable Kanaele mit einer Leitfaehigkeit von 80 pS zu bilden. Durch die Beteiligung von HlyD werden allerdings die Transportporen in E. coli wahrscheinlich vergroessert. Fuer 3'-terminal gelegene hlyD-Mutationen, die zu einem inaktiven HlyA-Transport fuehren koennen, konnten wir zwei Typen von Suppressormutationen erhalten, die in hlyD oder hlyB liegen und wieder zu einer fast wildtypischen Transporteffizienz von HlyA fuehren. Diese Ergebnisse deuten auf eine Wechselwirkung zwischen dem C-Terminus von HlyD und den periplasmatischen Loops von HlyB innerhalb der Transportpore hin. Durch Konstruktion eines spezifischen Transposons (TnhlyAs) und eines Sekretionsvektors konnten wir Werkzeuge entwickeln, die es gestatten, das HlyA-Sekretionssignal an beliebige Stellen in ein Gen zu inserieren. Dadurch entstehen Fusionsproteine mit unterschiedlicher Laenge des Reporterproteins, die alle am C-termialen Ende das HlyA-Sekretionssignal tragen. Damit lassen sich Proteinsequenzen identifizieren, die transportkompetent- oder inkompetent sind.

Von diesen Untersuchungen haben wir eine genauere Kenntnis der Struktur und Funktion dieses wichtigen alternativen Proteintransportapparates von Gram-negativen Bakterien, der schon heute bedeutende praktische Anwendungen im Bereich der Immunologie zur Isolierung und Praesentation von Antigenen gefunden hat .

Forschungsergebnisse/allgemeiner UEberblick, B 10

a-Haemolysin von Escherichia coli ist ein porenbildendes, Ca2+-abhaengiges Cytolysin, das zu der Familie der RTX (Repeats in toxin)-Toxine gehoert. Es wird haeufig von E. coli-Staemmen produziert, die extraintestinale Infektionen beim Menschen und bei Saeugetieren verursachen und stellt einen wichtigen Virulenzfaktor in der Pathogenese dieser Infektionskrankheiten dar. a-Haemolysin wird in E. coli zunaechst in Form eines inaktiven Protoxins (proHlyA) von 110 kDa synthetisiert und noch vor seiner Sekretion aus der Bakterienzelle durch Fettsaeureacylierung aktiviert. Diese Aktivierung ist von dem cytoplasmatischen Protein HlyC abhaengig, das mit proHlyA koexprimiert wird. Die extrazellulaere Sekretion des reifen a-Haemolysins (HlyA) erfolgt mit Hilfe eines spezifischen Transportapparats, der aus zwei integralen Proteinen der Cytoplasmacalacetin, HlyB und HlyD, sowie dem in der aeusseren calacetin verankerten TolC zusammengesetzt ist. HlyA wirkt aufgrund seiner porenbildenden Aktivitaet stark cytotoxisch und cytolytisch auf verschiedene Zelltypen wie Erythrozyten, Leukozyten, Endothel- und Epithelzellen. Sublytische Konzentrationen des Toxins induzieren darueberhinaus in verschiedenen eukaryontischen Zellen eine Veraenderung der normalen Funktionen.

In der vergangenen Antragsperiode haben wir den Mechanismus und die Funktion der HlyC-gesteuerten Aktivierung des a-Haemolysins eingehend untersucht. Dabei ergab sich, dass proHlyA in E. coli quantitativ an zwei internen Lysinresten, Lys-564 und Lys-690, kovalent fettsaeureacyliert wird und dass beide Modifikationen essentiell sind, um wildtypische haemolytische Aktivitaet zu erlangen. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die Fettsaeureacylierung von Lys-564 und Lys-690 unabhaengig voneinander erfolgt, aber von Aminosaeuresequenzen in der unmittelbaren Nachbarschaft des entsprechenden Lysinrests abhaengt. Diese flankierenden Sequenzen dienen moeglicherweise als Bindungsstellen fuer HlyC. Untersuchungen an kuenstlichen Lipidcalacetinen ergaben, dass die Fettsaeureacylierung des Haemolysinproteins nicht fuer die Bildung der Transcalacetinpore essentiell ist, sondern die effiziente Bindung des Toxins an Zielcalacetinen ermoeglicht und dadurch seine porenbildende Aktivitaet erhoeht.

Wir konnten bereits vor einigen Jahren zeigen, dass die Bindung des E. coli-a-Haemolysins an Erythrozyten auch von der Bindung von Ca2+ an eine Serie von 13 hintereinander angeordneten, neun Aminosaeuren langen Repeats in der C-terminalen Haelfte des Haemolysinproteins abhaengt. Um die Spezifitaet dieser Ca2+-Abhaengigkeit zu untersuchen, wurde HlyA unter praktisch Ca2+-freien Bedingungen exprimiert und seine haemolytische Aktivitaet nach Zugabe verschiedener Konzentrationen von Ca2+ bzw. anderen di- oder trivalenten Kationen untersucht. Fuer die Ca2+-induzierte haemolytische Aktivitaet ergab sich dabei eine Halbsaettigungskonstante (Km) von 120 ?M. Ca2+ konnte nur durch Sr2+, das einen aehnlichen Ionendurchmesser hat, vollstaendig ersetzt werden (Km 1.5 mM). Ba2+ vermittelte nur geringe Aktivitaet (Km ca. 8 mM). Mg2+ und verschiedene andere di- und trivalente Kationen zeigten keinen positiven Effekt. Fuer die Bildung der Transcalacetinpore ist Ca2+ jedoch nicht essentiell. Untersuchungen an kuenstlichen Lipidcalacetinen zeigten vielmehr, dass die Einzelkanalleitfaehigkeit der HlyA-Pore in Gegenwart di- oder trivalenter Kationen um bis zu 50% absinkt (Km fuer divalente Kationen <5 mM, fuer trivalente Kationen <50 ?M). Dieser Effekt wird vermutlich durch die Bindung der Kationen an negativ geladene Gruppen an der Porenoeffnung verursacht.

Die fuer die Bildung der kationenselektiven Transcalacetinpore verantwortliche Region des HlyA-Proteins konnte durch die Analyse von HlyA-Mutanten mit spezifischen Deletionen auf vier hydrophobe, putativ a-helicale Sequenzen von je 21 Aminosaeuren und flankierende Sequenzen in der N-terminalen Haelfte von HlyA eingegrenzt werden. Prolinsubstitutionen in den hydrophoben Sequenzen fuehrten zu einer signifikanten Inhibierung oder zum Verlust der haemolytischen und porenbildenden Aktivitaet und untermauerten somit die vermutete a-helicale Sekundaerstruktur dieser Sequenzabschnitte. AEhnliche Prolinsubstitutionen in der Umgebung der hydrophoben Sequenzen hatten dagegen meist keinen negativen Effekt. Die Analyse der Aktivitaet weiterer Deletionsmutanten und Computer-gestuetzte Strukturvorhersagen liessen vermuten, dass neben den vier hydrophoben a-helicalen Sequenzen mehrere amphipatische b-Straenge zur Ausbildung der Pore beitragen. Positive Komplementationen zwischen verschiedenen inaktiven HlyA-Mutanten zeigten darueberhinaus, dass die Porenbildung hoechstwahrscheinlich mit einer Oligomerisierung von HlyA verbunden ist. Unter Verwendung von HlyA-Mutanten mit gezielten Deletionen in der Repeat-Region bzw. in der porenbildenden Region konnte auch gezeigt werden, dass die a-Haemolysin-induzierte Freisetzung von Entzuendungsmediatoren aus Leukozyten nicht nur von der Bindung des Toxins an die Zielzellcalacetin, sondern auch von der Bildung der Transcalacetinpore abhaengt.

Mit Hilfe des kuenstlichen Lipidcalacetinsystems wurden auch die porenbildenden Eigenschaften anderer RTX-Toxine analysiert. Das EHEC-Haemolysin von enterohaemorrhagischen E. coli-Staemmen, die Haemolysine von Morganella morganii und Proteus vulgaris, sowie ApxI und ApxII von Actinobacillus pleuropneumoniae erzeugten Poren, die aehnliche Charakteristika aufwiesen wie a-Haemolysinporen. Einzelne Eigenschaften, wie die OEffnungszeit der Poren oder die pH-Abhaengigkeit der Einzelkanalleitfaehigkeit, variierten jedoch z.T. erheblich. ApxIII von A. pleuropneumoniae und vor allem das Adenylatzyklasetoxin von Bordetella pertussis erzeugten wesentlich kleinere Poren als die anderen RTX-Toxine. Die Ca2+-unabhaengigen Haemolysine von Serratia marcescens und Vibrio cholerae El Tor, die keine Homologie zum a-Haemolysin aufweisen, zeigten dagegen voellig andere Porenbildungseigenschaften als die RTX-Toxine. Das El Tor-Haemolysin erzeugt anionenselektive, stabile Poren, waehrend das Serratia-Haemolysin sehr heterogene Poren bildet, die keine deutliche Ionenselektivitaet haben.

Von besonderem Interesse war die Charakterisierung einer haemolytischen Aktivitaet, die in E. coli bei UEberexpression des chromosomal kodierten slyA-Gens von Salmonella typhimurium beobachtet werden konnte. Zunaechst wurde vermutet, dass das 17 kDa grosse SlyA-Protein ein Haemolysin/Cytolysin von S. typhimurium ist. Wir konnten jedoch kuerzlich zeigen, dass SlyA ein Regulationsprotein ist, das selbst keine haemolytische Aktivitaet besitzt, sondern in E. coli die Expression eines bisher unbekannten Haemolysins induziert. Weitere Analysen liessen vermuten, dass dieses Haemolysin ein zellassoziiertes, porenbildendes Protein ist.

Forschungsschwerpunkt, A 6

calacetinphysiologie, Molekularphysiologie, Nierenphysiologie, Atomic Force Mikroskopie.

Forschungsschwerpunkt, A 10

Aufklaerung von PDGF-induzierten Signalwegen in Mausfibroblasten: Bedeutung der Signale fuer Proliferation und Zellschutz, Identifzierung von fruehen und spaeten Signalen waehrend der Proliferationskontrolle. Charakterisierung von Apoptosesignalen in Fibroblastenkulturen.

Forschungsschwerpunkt, A 13

Neuropharmakologie / Aminerge Systeme

Forschungsschwerpunkt, A 14

Spezialisierte Epithelzellen im Sammelrohr der Niere (A-Schaltzellen) sind in der Lage, aktiv S,ure (H+-Ionen) in den sich bildenden Harn zu sezernieren. Das in der Zelle zurueckbleibende Basen,quivalent wird in Form von Bicarbonationen (HCO3-Ionen) durch die basolaterale Zellcalacetin in den Blutkreislauf abgegeben. Durch diesen Mechanismus kann einer sbers,uerung des Blutes (Azidose) entgegengewirkt werden. Das Transportprotein, welches Bicarbonationen durch die basolaterale Plasmacalacetin schleust, konnten wir als eine Spleiᶡriante (RenAE1) des HCO3-,Cl-Anionenausstauschers des Erythrozyten (EryAE1) identifizieren. Verschiedene Befunde sprechen dafuer, da᠒enAE1 an der basolateralen Plasmacalacetin durch Verankerung im Zytoskelett immobilisiert wird. Ein solcher Verankerungsmechanismus konnte von uns und anderen Ar-beitsgruppen auch fuer die Natriumpumpe (Na+,K+-ATPase) nachgewiesen werden. Die Niere und andere Gewebe enthalten Transkripte eines zweiten Anionenaustauschers, AE2. Der augenblickliche Forschungs-schwerpunkt befaᴊsich mit der Analyse funktioneller Dom,nen dieser Anionenaustauscher und ihre Lokalisie-rung in verschiedenen Geweben des Menschen und der Ratte.

Forschungsschwerpunkt, A 15

Entwicklung von Peptidlibraries und methodisch verwandten, synthetischen (kombinatorischen) Bibliotheken und deren Anwendung zur Erforschung der Strukturfunktionsbeziehungen bei der Signaltransduktion, wobei auch intrazellulaere Prozesse und die fuer Wachstum und Differenzierung wichtigen kleinen GTPasen einbezogen werden sollen.

Modelle fuer eine funktionale Rezeptorstruktur aus den NMR-abgeleiteten Konformationen von synthetischen Rezeptor-Peptiden in Gegenwart von synthetischen Vesikeln

Forschungsschwerpunkt, A 16

Signaltransduktion am humanen Interleukin-4 Rezeptor Komplex

Forschungsschwerpunkt, A 17

Untersuchungen zur Regulation des Natrium-D-Glukosekotransporters in Gewebekulturzellen mit besonderer Beruecksichtigung des Proteins RS1. Herstellung von permanent mit SGLT1 und RS1 transfizierten Zellinien. Erzeugung einer ,Knock-out-Maus" zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung von RS1. Untersuchungen der Expression und Funktion des Natrium-D-Glukosekotransporters im Gehirn.

Forschungsschwerpunkt, A 19

Signaltransduktion, Wachstums- und Differenzierungskontrolle, Protein Kinase Kaskaden und deren Regulatoren.

Forschungsschwerpunkt, A 18

Rezeptorpharmakologie / Signaltransduktion

Forschungsschwerpunkt, A 20

Signaltransduktion in Tumorzellen: Analyse der melanominduzierenden Rezeptortyrosinkinase Xmrk von Xiphophorus

Forschungsschwerpunkt, A 21

Die Aufklaerung von inhibitorischen Signalwegen kardiovaskulaerer Zellen (z.B. Thrombozyten, Endothelzellen, vaskulaere glatte Muskelzellen) wird weltweit intensiv bearbeitet (siehe Referenzen 1-4 als UEbersicht). Von diesen Forschungsbemuehungen erhofft man sich u.a. eine Aufklaerung von Ursachen sowie die Entwicklung neuer therapeutischer Ansaetze fuer wichtige kardiovaskulaere Erkrankungen wie Arteriosklerose, Herzinfarkt und Schlaganfall. Der Schwerpunkt unserer Gruppe innerhalb dieses Forschungsgebietes liegt in der Aufklaerung der cGMP-vermittelten Signaltransduktion. Im Rahmen dieses Teilprojektes konnten wir in den letzten Jahren ein 46/50 kDa Phosphoprotein (VASP, Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein) reinigen sowie proteinchemisch und zellbiologisch charakterisieren. VASP wird in humanen Thrombozyten, aber auch in humanen vaskulaeren glatten Muskelzellen und Endothelzellen in Antwort auf cAMP- und cGMP-erhoehende Vasodilatatoren (Pharmaka, Endothelfaktoren etc.) phosphoryliert, wobei die Phosphorylierung durch cAMP- und cGMP-regulierte Proteinkinasen vermittelt wird und sehr gut mit der Hemmung der Agonist-vermittelten Calcium-Antwort und weiteren Zellfunktionen korreliert.

Forschungsschwerpunkte, B 2